Utilisateur:Horadus/Brouillon
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aide mémoire, voir Rémi Besson CHR, de la part de Florent Lamiot
Séquençage haut débit (page séquençage de l'ADN)
modifierQuelques dates
modifierLes techniques
modifierÉtapes communes aux différentes technologies :
- Fragmentation enzymatique de l'ADN
- préparation d'une banque d'ADN (library) par ligation d'adaptateurs
- amplification clonale
- séquençage générant des signaux luminescent ou fluorescent
- détection des signaux émis et conversion en séquence
1. Pyroséquencage
modifier2. Séquençage à l'aide de terminateurs réversibles / reverse dye terminator (RDT)
modifier3. Séquençage par ligation
modifier4. séquençage par mesure ionique
modifierApplications
modifierhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.doc-distant.univ-lille2.fr/pmc/articles/PMC4260045/
Coût/bénéfice ?
modifierhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.doc-distant.univ-lille2.fr/pubmedhealth/PMH0072173/pdf/TOC.pdf
En biologie moléculaire, le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (ou RFLP, de l'anglais restriction fragment length polymorphism) est utilisé dans deux sens :
- comme une caractéristique des molécules d'ADN permettant de les distinguer les unes des autres,
- comme la technique de laboratoire qui utilise cette caractéristique pour différencier ou comparer des molécules d'ADN. Cette technique est utilisée pour la réalisation d'empreintes génétiques et dans les tests de paternité.
Méthode
modifierÉtapes de la technique RFLP :
- extraction d'ADN,
- hydrolyse de l'ADN par une enzyme de restriction,
- séparation des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose,
- dénaturation de l'ADN par la soude pour obtenir de l'ADN monocaténaire,
- transfert sur membrane, renforcement de la fixation.
- visualisation des fragments par hybridation avec une sonde.
L'ADN d'un individu ou d'une cellule est d'abord extrait et purifié. L'ADN est ensuite coupé en fragments de restriction par une enzyme de restriction, cette dernière coupant l'ADN au niveau d'une séquence qui lui est spécifique (site de restriction). Les fragments d'ADN ainsi obtenus, nommés fragments de restriction, sont ensuite séparés selon leur longueur par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel obtenu est ensuite analysé par Southern Blotting et révélé avec une ou plusieurs sondes.
Résultat
modifierLa distance entre deux sites de coupure de l'enzyme de restriction (site de restriction) varie selon les individus (du fait du polymorphisme des individus) : de ce fait la longueur des fragments de restriction varie. Les positions de certaines bandes d'ADN (sur le gel d'électrophorèse) seront donc différentes d'un individu à l'autre. Le polymorphisme existant entre individus d'une même espèce peut être ainsi visualisé grâce au polymorphisme de leur ADN. Cette technique permet de mettre en évidence les "particularités" d'un individu. Elle permet également de montrer les relations génétiques qui peuvent exister entre individus, du fait de la transmission des caractères génétiques de parents à enfant. La technique est également utilisée pour étudier les relations entre différentes espèces.