Milieu chromogène

Les milieux chromogènes sont très utilisés en microbiologie pour la mise en évidence d'activités enzymatiques par l'apparition d'une coloration spécifique. Leur introduction au laboratoire doit beaucoup à Alain Rambach.

La coupure par l'enzyme d'un substrat dit chromogène produit une molécule colorée, le chromophore. Pour les milieux chromogènes, le chromophore précipite au niveau de la colonie. Cette technique est différente de la mise en évidence d'activités par l'action des produits de la rédaction sur un indicateur de pH, rarement un indicateur rédox, du milieu.

Exemples

Le premier chromogène rencontré est l'ONPG (orthonitrophénylgalactoside) dont l'hydrolyse, par la β-galactosidase (ou ONPG-hydrolase) libère l'ONP (orthonitrophénol ou 2-nitrophénol) de coloration jaune. De très nombreuses enzymes sont mises en évidence par ce type de technique.

La diffusion de l'utilisation de chromogènes est devenue très importante par leur incorporation dans les milieux de culture : les colonies sont ainsi colorées par le ou les chromophore(s). Des colonies sont naturellement colorées ; la lecture est alors complexe car les couleurs peuvent s'additionner.

L'association de plusieurs chromogènes est souvent réalisée, par exemple la recherche de la β-glucuronidase et de la β-glucosidase dans les milieux destinées à l'analyse des urines en biologie médicale. D'autres enzymes sont recherchées pour les urines comme dans le milieu UTI (voir image ci-dessous)

Milieu URI Deux types de colonies sur URI. Les colonies rouges sont β-galactosidase +, coliformes probables. Les petites colonies bleues sont β-glucosidase + et sont des Enterococcus. Les grosses colonies bleues peuvent être des Klebsiella-Enterobacter-Serratia. Deux types de colonies sur URI. Les colonies rouges sont β-galactosidase +, coliformes probables. Les petites colonies bleues sont β-glucosidase + et sont des Enterococcus. Les grosses colonies bleues peuvent être des Klebsiella-Enterobacter-Serratia.	Milieu CPSE Milieu adapté au diagnostic des infections urinaires, par la mise en évidence d'une activité β-glucuronidase, il permet une identification directe d'Escherichia coli responsable de 80 % des cystites en France (40 % à l’hôpital), il permet aussi la mise en évidence de l'activité β-glucosidase chez les entérocoques et certaines entérobactéries (Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Citrobacter). Orientation possible vers Proteus grâce à la mise en évidence de l'activité TDA par addition d'une goutte de chlorure de fer III. La production d'indole est mise en évidence éventuellement par une goutte de réactif (Kovacs par exemple). Dans certaines compositions, du fer III dans le milieu visualise directement la TDA par une couleur brune autour des colonies TDA +. Proteus (TDA+) sur CPSE.
Milieu Chromagar pour les levures Autre exemple avec le milieu Chromagar pour les levures. Isolement de levures sur Chromagar (à compléter de la nature des enzymes et l'identification correspondante).	Milieu SALM  Milieu sélectif des bactéries à Gram négatif qui permet la mise en évidence de Salmonella dans les selles grâce à la révélation d'une activité estérase que spécifique des salmonelles. Salmonella enterica enterica sérotype Enteritidis isolé sur SM2 à partir d'une coproculture.
CAN2  Milieu sélectif des levures qui permet la mise en évidence de Candida albicans par la mise en évidence de l'activité hexosaminidase. Culture de Candida albicans sur CAN2.

Milieux existants

De nombreux milieux chromogènes existent. Malheureusement, les fabricants ne donnent pas toujours le nom des activités enzymatiques recherchées mais seulement les couleurs obtenues. Les tableaux ci-dessous (en préparation) tente une approche exhaustive qui devra être complétée.

Enzymes recherchées	Taxons correspondants
α-Glucosidase	Staphylococcus aureus
β-Glucosidase	Listeria monocytogenes, Enterococcus-Klebsiella-Enterobacter, Serratia, Hafnia (KESH), Bacillus cereus, Clostridium perfringens
α-Galactosidase	E. coli O157
β-Galactosidase	Coliformes (1)
β-Glucuronidase	E. coli
β-D-Ribofuranosidase
β-D-N-Acétylgalactosaminidinase	Candida albicans
Estérase	Salmonella
Phosphatidyl-myoinositol-1-phosphate phospholipase C	Probablement Listeria monocytogenes
β-Alanylaminopeptidase	Probablement Pseudomonas aeruginosa
β-Xylosidase
Phosphatase

Les milieux chromogéniques sont composés pour assurer la culture et une sélection, aussi importante que possible, des microorganismes cibles.

Liste non exhaustive de milieux chromogènes

Nom du milieu	Enzymes recherchées	Utilisation
Uriselect Biorad	β-Galactosidase et β-glucuronidase	Analyse des urines en biologie médicale
CPSE Biomérieux	β-Glucosidase et β-glucuronidase	Analyse des urines en biologie médicale
UTI	β-Glucosidase et β-galactosidase	Analyse des urines en biologie médicale
Chrom Id VRE	β-Glucosidase	Recherche des Enterococcus résistants aux glycopeptides
HiChrom rapid Enterococci Agar	α-Glucosidase, β-glucosidase, β-galactosidase	Recherche d'Enterococcus
Chrom Id VRE E. coli O157	β-Glucosidase, β-galactosidase	Recherche d'E. coli O157
ALOA (Listeria monocytogenes)	β-Glucosidase	Dénombrement des Listeria monocytogenes
Nombreux milieux	β-Glucuronidase	Dénombrement d'E. coli (microbiologie alimentaire)
Candiselect Biorad	β-D-N-Acétylgalactosaminidinase	Recherche de Candida albicans
CAN2 Biomérieux ou ChromId Candida	β-D-N-Acétylgalactosaminidinase et phosphatase	Recherche de Candida albicans
HiChrom OGYE	β-Xylosidase
Bacillus cereus HiCrome Agar	β-Glucosidase	Dénombrement de Bacillus cereus
SAIDE Biomérieux	α-Glucosidase probablement	Staphylococcus aureus
MRSA [Bio-Rad Laboratories (MRSASelect), Becton Dickinson (CHROMagar MRSA) bioMérieux (chromID MRSA)]	α-Glucosidase probablement	Recherche des SARM
ESBL Biomérieux [BBL CHROMagar ESBL]	Probablement β-glucosidase et β-glucuronidase (comme pour les urines)	Recherche des entérobactéries productrices de BLSE
STRB Biomérieux [chromID Strepto B…]		Recherche des streptocoques du groupe B

Nature des chromophores

Les chromogènes et les chromophores ne doivent pas être toxiques pour les bactéries recherchées, à la concentration utilisée.

Un exemple de chromophore pour la β-glucuronidase :

4-Méthylumbeliferone-bêtaglucuronide.

Mais d'autres substrats sont possibles pour cette enzyme probablement en raison des droits de brevets.

Autres exemples de chromogènes

4-Méthyl-umbelliférone, ex. : 4-méthylumbelliféryl-β-glucuronide.	Alizarine (elle peut être substituée), ex. : alizarine-β-glucuronide.	Radical indoxyl, ex. : avec substitutions possibles : * le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide ; * le 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-β-glucuronide ; * le 6-chloro-3-indolyl-β-glucuronide.
Formule à déterminer, probablement protégée par le secret industriel, ex. : aldol-β-glucuronide	Formule à déterminer Cyclohexènoesculetine-β-glucuronide

Bibliographie

• Catherine de Beaumont, Intérêt des milieux chromogènes en microbiologie, 2006.
• Jean-Noël Joffin et Guy Leyral, Dictionnaire des techniques, Microbiologie technique, CRDP d'Aquitaine (voir www.reseau-canope.fr/).
• Alain Rambach, Opéron n^o 102, article de l'initiateur des milieux chromogènes.